Kit de mutagenèse rapide dirigée sur site

Modèle A-1

■ La matrice contient des impuretés protéiques ou des inhibiteurs de Taq, etc. ——Purifiez la matrice d'ADN, éliminez les impuretés protéiques ou extrayez l'ADN matrice avec des kits de purification.

■ La dénaturation de la matrice n'est pas complète ——Augmentez de manière appropriée la température de dénaturation et prolongez le temps de dénaturation.

■ Dégradation du modèle ——Repréparez le modèle.

A-2 Apprêt

■ Mauvaise qualité des amorces —— Re-synthétiser l'amorce.

■ Dégradation des amorces ——Aliquoter les amorces à haute concentration dans un petit volume pour la conservation. Éviter les congélations et décongélations multiples ou la cryoconservation à 4°C à long terme.

■ Conception incorrecte des amorces (par exemple, longueur d'amorce insuffisante, dimère formé entre les amorces, etc.) -Reconception des amorces (éviter la formation de dimère d'amorce et de structure secondaire)

A-3 mg²⁺concentration

■ mg²⁺ la concentration est trop faible ——Augmentez correctement Mg²⁺ concentration : Optimiser le Mg²⁺ concentration par une série de réactions de 1 mM à 3 mM avec un intervalle de 0,5 mM pour déterminer le Mg optimal²⁺ concentration pour chaque matrice et amorce.

A-4 Température de recuit

■ La température de recuit élevée affecte la liaison de l'amorce et de la matrice. ——Réduire la température de recuit et optimiser la condition avec un gradient de 2°C.

A-5 Temps de prolongation

■ Durée d'extension courte——Augmente la durée d'extension.

Phénomènes : Les échantillons négatifs montrent également les bandes de séquence cible.

A-1 Contamination de la PCR

■ Contamination croisée de la séquence cible ou des produits d'amplification —— Veillez à ne pas pipeter l'échantillon contenant la séquence cible dans l'échantillon négatif ou à ne pas les renverser hors du tube de centrifugation. Les réactifs ou l'équipement doivent être autoclavés pour éliminer les acides nucléiques existants, et l'existence d'une contamination doit être déterminée par des expériences de contrôle négatif.

■ Contamination des réactifs ——Aliquoter les réactifs et conserver à basse température.

A-2 Premierr

■ mg²⁺ la concentration est trop faible ——Augmentez correctement Mg²⁺ concentration : Optimiser le Mg²⁺ concentration par une série de réactions de 1 mM à 3 mM avec un intervalle de 0,5 mM pour déterminer le Mg optimal²⁺ concentration pour chaque matrice et amorce.

■ Conception d'amorce incorrecte et la séquence cible présente une homologie avec la séquence non cible. —— Re-conception des amorces.

Phénomènes : Les bandes d'amplification PCR ne correspondent pas à la taille attendue, qu'elles soient grandes ou petites, ou parfois des bandes d'amplification spécifiques et des bandes d'amplification non spécifiques se produisent.

A-1 Apprêt

■ Mauvaise spécificité d'amorce

——Amorce de refonte.

■ La concentration d'amorce est trop élevée ——Augmentez correctement la température de dénaturation et prolongez le temps de dénaturation.

A-2 mg²⁺ concentration

■ Le magnésium²⁺ la concentration est trop élevée ——Réduire correctement la concentration de Mg2+ : Optimiser la concentration de Mg²⁺ concentration par une série de réactions de 1 mM à 3 mM avec un intervalle de 0,5 mM pour déterminer le Mg optimal²⁺ concentration pour chaque matrice et amorce.

A-3 Polymérase thermostable

■ Quantité d'enzyme excessive ——Réduire la quantité d'enzyme de manière appropriée à des intervalles de 0,5 U.

A-4 Température de recuit

■ La température de recuit est trop basse ——Augmentez la température de recuit de manière appropriée ou adoptez la méthode de recuit en deux étapes

Cycles de PCR A-5

■ Trop de cycles PCR ——Réduisez le nombre de cycles PCR.

A-1 Apprêt——Mauvaise spécificité ——Re-concevoir l'amorce, changer la position et la longueur de l'amorce pour améliorer sa spécificité; ou effectuer une PCR nichée.

A-2 ADN modèle

——La matrice n'est pas pure ——Purifiez la matrice ou extrayez l'ADN avec des kits de purification.

A-3 mg²⁺ concentration

——Mg²⁺ la concentration est trop élevée ——Réduire correctement le Mg²⁺ concentration : Optimiser le Mg²⁺ concentration par une série de réactions de 1 mM à 3 mM avec un intervalle de 0,5 mM pour déterminer le Mg optimal²⁺ concentration pour chaque matrice et amorce.

A-4 dNTP

——La concentration de dNTP est trop élevée ——Réduire la concentration de dNTP de manière appropriée

A-5 Température de recuit

——Température de recuit trop basse ——Augmenter la température de recuit de manière appropriée

A-6 Cycles

——Trop de cycles ——Optimiser le nombre de cycles

La première étape consiste à choisir la polymérase appropriée. La polymérase Taq régulière ne peut pas relire en raison du manque d'activité de l'exonucléase 3'-5', et le mésappariement réduira considérablement l'efficacité d'extension des fragments. Par conséquent, la polymérase Taq normale ne peut pas amplifier efficacement les fragments cibles de plus de 5 kb. La polymérase Taq avec une modification spéciale ou une autre polymérase haute fidélité doit être sélectionnée pour améliorer l'efficacité d'extension et répondre aux besoins d'amplification de fragments longs. De plus, l'amplification de longs fragments nécessite également un ajustement correspondant de la conception de l'amorce, du temps de dénaturation, du temps d'extension, du pH du tampon, etc. Habituellement, les amorces avec 18-24 pb peuvent conduire à un meilleur rendement. Afin d'éviter d'endommager la matrice, le temps de dénaturation à 94°C doit être réduit à 30 secondes ou moins par cycle, et le temps d'élévation de la température à 94°C avant l'amplification doit être inférieur à 1 min. De plus, le réglage de la température d'extension à environ 68°C et la conception du temps d'extension en fonction de la vitesse de 1 kb/min peuvent garantir une amplification efficace de longs fragments.

Le taux d'erreur de l'amplification PCR peut être réduit en utilisant diverses ADN polymérases avec une haute fidélité. Parmi toutes les ADN polymérases Taq trouvées jusqu'à présent, l'enzyme Pfu a le taux d'erreur le plus bas et la fidélité la plus élevée (voir tableau ci-joint). En plus de la sélection d'enzymes, les chercheurs peuvent réduire davantage le taux de mutation PCR en optimisant les conditions de réaction, notamment en optimisant la composition du tampon, la concentration de polymérase thermostable et en optimisant le nombre de cycles de PCR.